细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系
慢病毒包装:公司使用3质粒慢病毒包装系统,慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G,过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统,将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中,培养48h后,收集上清。(3)从中间剪断股骨和胫骨,用2ml无菌注she器吸取DMEM/F12溶液冲出gu髓细胞多次,再用针头吹打,吸管吸入离心管内,1000r/min离心5min,弃上清,用PBS重悬细胞。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化试剂盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度,其余病毒冻存于-80℃冰箱中。
滴度检测:将病毒颗粒使用梯度稀释,分别293T细胞,72h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。
细胞:在病毒前一天对细胞进行计数,接种约10000个细胞于12孔板中,培养过夜后使用无培养基稀释病毒,加入12孔板中对细胞进行,病毒数量根据推荐细胞的MOI加入(若无推荐MOI,需做病毒梯度:1,5,10,50,100 5个梯度对细胞),6h后去除含病毒溶液,加入完全培养基细胞培养,培养48h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。同时加入puromycin对细胞筛选,筛选约2周时间。细胞筛选好后,使用定量PCR和Western blot检测目的基因的稳定表达情况。
实验流程:慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定
结果示例:
图 A 病毒滴度检测;B 目的细胞病毒效果图
3D细胞培养
3D多细胞肿liu球是在体外应用组织培养方法使肿liu细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。与传统的2D贴壁细胞培养模型相比,3D多细胞肿liu球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用,从而更加贴近肿liu组织中相应的病理生理特征。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。因此, 3D多细胞肿liu球培养模型已经逐渐应用于gan细胞培养和分化、ai症研究、yao物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。虽然3D多细胞肿liu球模型具有更显著的实体肿liu生理相关性,但是与2D贴壁细胞培养模型相比,获得大量相对统一的3D多细胞肿liu球模型需要-系列的培养过程和表征手段。
大鼠脂肪的分离
将手术切取的大鼠脂肪组织尽量剪碎后移至离心管,其余步骤与人脂肪的分离一致。
经手术切除获得的大鼠皮下脂肪组织消化后原代培养24 h,且肉眼观察会发现培养瓶底部贴附着一层网状薄膜,轻轻摇晃培养瓶可使这层网状薄膜从瓶壁上脱落,镜下观 察发现大部分细胞都附着于这层膜上,通过术获取的人脂肪组织消化后则无此现象。增加胶原酶的量和消化时间也无法避免,取材时的或脂肪间结缔组织未被完全消化,穿过细胞筛进入了培养瓶并沉淀于瓶底部形成的。胶原蛋白酶虽然可以特异性水解胶原蛋白的三维螺旋结构,但不会损伤其他蛋白质。间接标记有放大作用,因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用。处理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的细胞筛过滤后传代。 根据作者的经验,每毫升手术切除的大鼠脂肪可分离基质血管成分细胞约1.81×106个。原代培养2.24×10^7个大鼠基质血管成分细胞,40 h后传代时约剩余 6.2×10^6个细胞,细胞剩余率27%。
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